Từ thời vua Loethai, vương quốc Sukhothai bắt đầu suy yếu. Các chư hầu của Sukhothai bắt đầu công khai chống lại. Một trong số đó là khu vực Suphanburi do U Thong cai trị. Năm 1348, U Thong đã dời trung tâm của mình xuống đồng bằng Chao Phraya. Trên một cù lao sông, ông cho lập kinh đô mới gọi là Ayutthaya, đặt tên theo Ayodhya ở Bắc Ấn Độ, thành của anh hùng Rama trong sử thi Hindu Ramayana. U Thong tiếp tục vương hiệu Ramathibodi (1351-69).

Năm 1360, Ramathibodi tuyên bố Phật giáo Thượng tọa bộ là quốc giáo của Ayutthaya và đưa các thành viên của một tăng đoàn từ Tích Lan để thiết lập các trật tự tôn giáo mới và truyền giáo cho các thần dân của mình. Ông cũng cho biên soạn một đạo luật, dựa trên Dharmashastra của Ấn Độ (một văn bản luật Hindu) và luật tục Thái, đây là những pháp chế của hoàng gia. Viết bằng chữ Pali—một ngôn ngữ thuộc nhóm Ấn-Aryan gần gũi với tiếng Phạn và là ngôn ngữ của các kinh điển Phật giáo Nam truyền - nên nó như có sức mạnh của thần linh. Thêm các quy định hoàng gia nữa, đạo luật của Ramathibodi nhìn chung có hiệu lực cho đến tận cuối thế kỷ 19.

Ramathibodi cố gắng mở rộng vương quốc của mình bằng cách chinh phục các vương quốc khác ở miền Bắc gồm Sukhothai, Kamphaeng Phet và Phitsanuloke. Vào cuối thế kỷ 14, Ayutthaya đã được xem là cường quốc mạnh nhất Đông Nam Á. Nhưng vương quốc này không phải là một quốc gia thống nhất và đơn nhất, mà là một chắp vá của các tiểu vương quốc tự trị và các tỉnh chư hầu trung thành với quốc vương của Ayutthaya theo hệ thống Mandala. Các tiểu vương quốc này do các hoàng thân của Ayutthaya trị vì, có quân đội riêng và đánh lẫn nhau. Quốc vương phải cảnh giác để đề phòng các hoàng thân liên kết với nhau chống lại ông hoặc liên kết với kẻ thù của Ayutthaya. Khi có tranh chấp về sự kế vị ngai vàng, các hoàng thân đã đưa quân về kinh đô để tăng sức ép.

Trong suốt thế kỷ 15, các nỗ lực của Ayutthaya hướng về bán đảo Malay, nơi có trung tâm thương mại lớn Malacca nhằm tranh giành quyền bá chủ. Malacca và các quốc gia Malay khác ở phía Nam của Tambralinga đã theo đạo Hồi từ đầu thế kỷ và do đó, Hồi giáo đã là một biểu tượng của sự đoàn kết của người Malay chống lại người Thái. Dù thất bại trong việc khuất phục quốc gia Malacca làm chư hầu, Ayutthaya tiếp tục kiểm soát việc buôn bán béo bở trên eo đất, thu hút nhiều nhà buôn Trung Hoa mua đặc sản về cho thị trường sa hoa của Trung Hoa.

Năm 1767, Myanma xâm chiếm Ayutthaya, phá hủy hoàn toàn kinh đô Ayutthaya và kết thúc kỷ nguyên của quốc gia kiêu hãnh của người Thái. Đây là một trong nhiều cuộc xâm lăng trong suốt lịch sử của người Thái Lan từ nước láng giềng Myanma - quốc gia hùng mạnh nhất Đông Nam Á thời kỳ đó.